友康生物
2023-04-14
公司熱點4月7日-8日，友康生物受邀參加了中國醫(yī)藥生物技術協(xié)會主辦的干細胞臨床研究研討會。在大會中友康的細胞類產(chǎn)品吸引了眾多行業(yè)專家、客戶以及行業(yè)同仁們的目光?；诩钨e們的熱烈反饋，友康在此基礎上于4月11日舉辦了產(chǎn)品衛(wèi)星宣講會，更深層次解答了大家的疑問。會議內(nèi)容干貨滿滿，以下整理會議精粹，以饗讀者！
直播概述
一、GMP級MSC無血清培養(yǎng)體系介紹
GMP級間充質(zhì)干細胞無血清培養(yǎng)基
產(chǎn)品優(yōu)勢：
√成分明確：蛋白種類不超過20種，總含量低于1.5mg/mL，全部為人工重組體系，無人源無動物源。
√連續(xù)傳代：無需更換培養(yǎng)基即可實現(xiàn)原代分離及高代次傳代。
√工業(yè)級培養(yǎng)：改善細胞貼壁性能，適合細胞產(chǎn)品的大規(guī)模生產(chǎn)及3D培養(yǎng)體系。
GMP級玻璃化細胞凍存液
產(chǎn)品優(yōu)勢：
√成分明確：無蛋白，無血清，無動物源成分，所有成分明確。
√通用性：無DMSO，無細胞毒性物質(zhì)，安全性高。
√簡易性：無需程序降溫，可直接投入-80°C，12h后，即可置于液氮中長期凍存。
√成本低：可以常溫運輸及保存，運輸成本大大降低。
二、MSC的原代分離及連續(xù)傳代工藝要點
◆供者篩選
1、倫理審核。
2、新生兒父母的遺傳病史、傳染病史、健康狀況。
3、知情同意書。
4、血檢HBV、HCV、HIV、TP。
◆臍帶組織的運送
1、臍帶運送液：臍帶運送過程中應4°C運輸，保存在液體環(huán)境中，不可干燥放置。
2、短距離運送（＜6h）可使用DPBS或生理鹽水加雙抗。
3、長距離運送（6-24h）建議使用完全培養(yǎng)基加雙抗。
4、臍帶進入實驗室后若不處理，應立刻放入4°C條件保存。
◆高效分離臍帶原代MSC
1. 將醫(yī)用剪刀、組織、手術柄、手術刀等器械提前滅菌。
2. 用含25mg/L慶大霉素的DPBS清洗臍帶3遍，然后用不含慶大霉素的DPBS清洗臍帶至清洗液無血色。
3. 使用剪刀將臍帶處理成2cm大小的組織段，每段組織沿帶靜脈將臍帶剪開。
4. 使用組織鑷撕去臍帶靜脈內(nèi)膜、外皮、兩根動脈使華通氏膠充分暴露。
5. 使用手術刀將華通氏膠剪切成邊長3-5mm 的小塊，每2cm組織段切成的華通氏膠小塊接種于一個150mm培養(yǎng)血中，使組織塊均勻分布，添加10mL-15mL完全培養(yǎng)基。
6. 24-48h 后，補充完全培養(yǎng)基至30mL。
7. 7天全量換液。
8. 10 天全量換液。
9. 12-14 天收獲原代細胞。
◆MSC的連續(xù)傳代
1. 在顯微鏡下觀察培養(yǎng)的MSC細胞 ，當細胞融合度達到80~90%，即可傳代。
2. 在超凈臺中，收集培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，加入10mL DPBS清洗細胞后棄去。
3. 加入適量干細胞溫和消化酶常溫下消化細胞。
4. 在顯微鏡下觀察到細胞全部收縮變圓，且有少量細胞開始流動時（一般2-5分鐘），立即加入溫和酶使用
量2倍體積的細胞培養(yǎng)上清或者DPBS稀釋細胞懸液。
5. 用移液器輕輕吹打瓶壁上未完全脫離的細胞，并輕輕吹打混勻，使細胞完全分散。
6. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移到離心管中，300g離心5 min。棄上清，加入2mL完全培養(yǎng)基重懸細胞，使用臺盼藍染色，
或流式細胞儀等方法計數(shù)。
7. 按密度8000cells/cm2 （原代培養(yǎng)基）或10000 cells/cm2（GMP級培養(yǎng)基）重新接種細胞。
8. 將培養(yǎng)瓶置于37℃，5%CO2 ，飽和濕度條件下培養(yǎng)。
三、全新CIK產(chǎn)品性能介紹
全新CIK細胞無血清培養(yǎng)套裝
產(chǎn)品優(yōu)勢：
√穩(wěn)定性：培養(yǎng)14天可獲得200倍以上細胞擴增，CD3+ CD56+比例達到30%以上。
√通用性：外周血和臍血來源的CIK均可培養(yǎng)，新鮮樣本與凍存樣本均可培養(yǎng)，僅需20~30mL血樣即可上樣培養(yǎng)。
√程序化：培養(yǎng)方式簡單易行，細胞狀態(tài)基本統(tǒng)一，按照推薦流程補液，無需進行細胞計數(shù)。
四、免疫細胞培養(yǎng)核心要點
1、為了避免抗凝劑占比過高影響自體血漿的使用，應使臍血中的抗凝劑占比低于30%。
2、每次補液時添加的培養(yǎng)基需預溫，用多少取多少，禁止將整瓶培養(yǎng)基預溫、禁止反復預溫。
3、剛?cè)氪鼤r，一般細胞培養(yǎng)袋大而細胞液體積小，建議將培養(yǎng)袋對折使用，選擇合適的底面積培養(yǎng)。
4、培養(yǎng)前期一定不要吹打細胞團（D0-D5），以減少細胞機械損傷。
答疑環(huán)節(jié)
1、Q:培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞時是否可以用酶解法處理臍帶？
A:可以用酶解法處理，但是酶的濃度和消化時間控制不好可能會損傷細胞膜，降低細胞活性，并且操作較植塊法更繁瑣，增加污染的機會，所以還是建議用植塊法。
2、Q:培養(yǎng)間充質(zhì)干細胞凍存樣本和新鮮樣本的操作區(qū)別是什么？
A:培養(yǎng)凍存樣本，其細胞活力和細胞數(shù)肯定會受到影響，所以相較于新鮮樣本，我們建議提高接種密度。
3、Q:分離單個核細胞時，紅細胞摻雜比較多，怎么改善？
A:一般臍血中會存在紅細胞摻雜比較多的問題，紅細胞會在5～7天時皺縮凋亡，但是它會影響單個核細胞的計數(shù)。一般有兩個處理方案：1、對臍血下層紅色液體，按照1:2的比例采用緩沖液進行稀釋；2、取少部分細胞懸液，做紅細胞裂解，從而達到對單個核細胞精確計數(shù)的目的。
4、Q:補液的時候不計數(shù)，如果細胞擴增數(shù)量很低，補液過多會對細胞生長有影響嗎？
A:友康的補液方案適用于大多數(shù)培養(yǎng)方案，最大程度也僅是1:2補液，有些經(jīng)驗非常老道的用戶甚至可以做到1:3或1:4的補液。按照我們的培養(yǎng)體系，幾乎沒出現(xiàn)過擴增倍數(shù)非常低的情況。
5、Q:免疫細胞成團分布，如果不吹打細胞團，會引起細胞老化嗎？
A:免疫細胞成團分布是一種非常正常的細胞形態(tài)，不吹打不會引起細胞老化。如果細胞團過大，可以在鏡下觀察，如果細胞團內(nèi)部呈現(xiàn)一種透亮的狀態(tài)，說明團塊內(nèi)部營養(yǎng)物質(zhì)很充足。如果團塊呈現(xiàn)出漆黑的狀態(tài)，此時可以適當考慮把細胞團塊吹散。
6、Q:分離單個核細胞白膜層時，升降速度對收集細胞的影響有什么影響？
A:離心機影響細胞收集的因素主要是升降速的穩(wěn)定性，降速不穩(wěn)會導致白膜層分離不出來。NK細胞收獲時，建議設置為700g 30min，升6降4，國產(chǎn)離心機升1降1。
7、Q:hUC-MSC消化時成片脫落是什么原因？胰蛋白酶0.05%和0.25%推薦哪個濃度？
A:一般有兩個原因會引起MSC消化時成片脫落：1.細胞密度太大，消化酶無法滲入細胞與細胞之間的細胞間質(zhì)中；2、消化酶的消化效力太快。如果使用胰蛋白酶，推薦0.25%的濃度，如果采用無血清體系培養(yǎng)，不建議使用胰蛋白酶，因為這會引入動物源成分。
8、Q:PBMC里的NK凍存復蘇后為還能繼續(xù)擴增嗎？
A:免疫類細胞的復蘇靜默期較長，一次凍存對于細胞質(zhì)量的影響非常大。培養(yǎng)完成的NK量非常大，經(jīng)過凍存后較難恢復到新鮮效果，成體NK細胞一般是直接用于臨床。
以上就是本次產(chǎn)品衛(wèi)星宣講會的精華內(nèi)容了，您還有其他問題，可以在我們的官網(wǎng)后臺留言，我們會第一時間為您解答！
